由单细胞分析发现ERG可以作为治疗前列腺癌的潜在靶点
研究背景
前列腺癌（Prostate cancer，PCa）是全球第二常见的男性恶性肿瘤，其发展涉及肿瘤细胞与周围上皮细胞和基质细胞的复杂相互作用，并可以多灶性发生。关于PCa分子变化的研究主要集中在未分类的整体组织样本上，前列腺上皮细胞中除了管腔和基底类型之外的其他细胞群作用以及PCa相关的肿瘤微环境变化尚不明确。本文通过单细胞RNA测序(scRNA-seq)识别与肿瘤发生相关的细胞状态以及肿瘤微环境变化，提示ERG可以作为治疗PCa的潜在靶点。
方法流程
Figure1 实验流程
研究结果
1、首次从PCa患者中注释出棒状细胞为临床诊断提供新思路
本研究对11名患者的前列腺癌组织样本（3个患者的6个活检样本，4个患者的根治性切除术样本，4个患者的肿瘤样本）进行单细胞测序，共分析了21743个细胞，聚类得到9个亚群，分别为上皮细胞、基质细胞（内皮细胞、成纤维细胞和平滑肌细胞）和免疫细胞（T细胞、髓系细胞、浆细胞、肥大细胞和B细胞）。所有样本几乎涵盖了前述主要的细胞的类型，其中占比最大的是上皮细胞。
Figure2 单细胞RNA测序局部PCa中主要细胞类型的鉴定
对上皮细胞重新进行聚类得到20个簇，根据之前正常前列腺组织单细胞分析结果注释到3个主要的细胞亚型，即基底上皮（Basal epithelial，BE）、管腔上皮（Luminal epithelial，LE）和其他上皮（Other epithelial，OE）。鉴于肿瘤细胞主要表达LE细胞标志物，具有高LE特征评分的簇可能是肿瘤细胞或非恶性LE细胞。由于PCa患者易发生TMPRSS2-ERG融合，不易发生其他的ETS融合。因此根据融合相关标志物的表达情况结合PCa肿瘤标志物表达情况，将LE亚群分为非恶性LE细胞、ERG阳性（ERG+）肿瘤亚群和ERG阴性（ERG-）肿瘤亚群。之前的研究结果表明，正常前列腺组织中还应含有丘细胞（Hillock cells）和棒状细胞（Club cells，Club），但在本研究中丘细胞未单独成簇，而Club标志物高表达范围与OE亚群几乎重合，且该亚群具有Club特征，故将OE亚群注释为Club。因此认为前列腺中的Club具有很大的研究潜力。
Figure3 鉴定肿瘤细胞和主要的上皮细胞类型（包括Club）
2、Club与PCa发病相关并参与雄激素信号传导为PCa治疗提供理论基础
对比其他上皮细胞，Club高表达管腔祖细胞（Luminal progenitor cells）标志物PSCA和PIGR。根据现有研究表明，肿瘤细胞增殖依赖于雄激素受体（Androgen receptor，AR）的活动。由于PCa中的Club并未被描述过，且在本次实验中仅注释出了Club，未注释出丘细胞，故认为Club可能与PCa的发病相关。为了验证这一假设，将PCa与健康对照组的Club重新聚类得到6个簇。根据相关基因的表达情况，发现簇0有管腔样和雄激素反应状态与AR通路下游基因表达情况一致。根据样本来源发现，前列腺癌Club（Prostate cancer club cells，Club PCa）比正常对照组有更高的雄性激素信号传导和LTFhigh和NKX3-1high的管腔样细胞状态的富集。
Figure4 鉴定具有上调雄激素反应特征的富含PCa的Club状态
为探究BE亚群中是否也存在类似的细胞状态，将BE细胞重新聚类得到9个亚群，其中簇6高表达雄激素信号通路下游的基因KLK2，KLK3，ACPP。与其他BE亚群相比，簇6亚群高表达管腔细胞标志物，印证这种细胞状态可能是与前列腺癌相关的管腔样细胞状态。
Figure5 BE和LE细胞的整合可识别PCa样本中富集的肿瘤相关细胞状态
3、PCa中三种主要上皮细胞在AR信号传导中均上调为PCa治疗提供新思路将所有PCa上皮细胞与来自先前分析的正常健康对照的前列腺上皮细胞整合分析，从三种主要类型的上皮细胞（Club、LE、BE）中鉴定肿瘤和正常样本之间的异质性，发现其与EGFR信号通路相关。由于BE和Club中两种富含PCa的细胞状态均显示出上调的AR信号，通过AR的表达情况和Hallmark雄激素特征通路反应评分，发现PCa样本中的3种主要上皮细胞在AR信号传导中均上调。
4、ERG可以作为治疗PCa的潜在靶点
为探究肿瘤细胞中是否存在不同的潜在细胞状态，故对ERG+和ERG-肿瘤细胞的亚结构进行研究。结果发现，ERG+肿瘤细胞以患者特异性方式聚集，而ERG-则没有。根据ERG状态对患者进行分类，只有ERG−肿瘤细胞的患者注释为ERG−患者，将其他患者（不包括ERG+肿瘤细胞和混合物）注释为ERG+患者。
为了鉴定肿瘤相关免疫细胞以及特定免疫细胞类型是否在ERG+或ERG-样本中差异富集，作者分析了T细胞亚群和基质细胞亚群，发现CD4两个簇分别富集在ERG+和ERG-患者中，成纤维细胞在ERG+患者中显著富集。通过信号通路分析发现，ERG-患者的BE细胞在所有的C2CP集合的19个通路中均显著上调，ERG−患者CD8 T细胞群在反应组PD-1和反应组干扰素-γ信号通路显著上调，通过测试发现与ERG-肿瘤细胞相关的CD4和CD8 T细胞代表了耗竭和细胞毒性的表型，表明ERG状态不太可能与较高的T细胞活化有关。此外，作者还研究了髓系细胞与肿瘤反应的相关性。发现M2型巨噬细胞与肿瘤进展相关，髓源性抑制细胞(Myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)的肿瘤相关髓系细胞可以在炎症、建立宿主免疫稳态和驱动PCa去势抵抗中发挥作用。
Figure7 ERG可以作为前治疗PCa的潜在靶点
综上，ERG-肿瘤细胞可能会产生独特的免疫细胞生态位和肿瘤微环境。虽然免疫检查点抑制在晚期去势抵抗性前列腺癌中的疗效有限，但ERG可以作为治疗Pca的潜在靶点进行研究。
结论
参考文献
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